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大豆抗原蛋白的生物學特性及其對仔豬的過敏反應

大豆含有豐富的蛋白質和平衡的氨基酸,是人和畜禽優質的植物性蛋白源(Hancock等,2000;Friedman和Brandon,2001)。但大豆中含有的多種抗營養因子因干擾營養物質的消化吸收、破壞正常的新陳代謝和引起不良的生理反應而危害著畜禽(尤其是幼齡畜禽)的健康,因此在很大程度上降低了大豆制品的利用效率。 

大豆抗原作為大豆中的主要抗營養因子之一,是大豆中能引起畜禽過敏反應的一類蛋白質,其主要包括:大豆疏水蛋白、大豆殼蛋白、大豆抑制蛋白、大豆空泡蛋白、大豆球蛋白(glycinin)和β-大豆伴球蛋白(β-conglycinin)等。自Duke(1934)首次發現大豆蛋白可引起嬰兒腹瀉、虛脫和腸道炎癥反應以來,人們對大豆蛋白的研究從未間斷,現已從嬰幼兒、仔豬和犢牛對大豆蛋白的過敏反應現象逐漸深入到大豆抗原蛋白的致過敏機理研究。本文從大豆抗原蛋白的生物學特性、對仔豬的影響、致敏機理以及加工對其免疫活性的影響等多個方面對大豆抗原蛋白的研究現狀和進展進行簡要的綜述。 

1 大豆抗原蛋白的種類、結構及其生物學特性 

大豆中的抗原蛋白有很多,目前已被確認的有21種(Wilson等,2005)。根據以蛋白質沉降系數為基礎的超速離心分類法,大豆蛋白分為4個組分,即2S、7S、11S和15S。其中11S組分為大豆球蛋白,占大豆可浸出蛋白總量的33%;15S組分為多聚體glycinin,占大豆可浸出蛋白總量的10%;2S組分占大豆可浸出蛋白總量的20%,主要包括胰蛋白酶抑制因子和細胞色素;其余部分為7S組分,主要含大豆伴球蛋白(conglycinin)、α-淀粉酶、脂肪氧化酶和凝集素(趙威祺,2003)。Catsimpoolas和Ekenstam(1969)用免疫電泳法將conglycinin分離并鑒定為α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin三種大豆伴球蛋白。目前研究較多的大豆抗原主要有大豆glycinin和β-conglycinin兩種球蛋白。 

1.1 Glycinin 

大豆glycinin(11S)是大豆中的一種主要貯藏蛋白,也是大豆蛋白中最大的單體成分,占大豆籽實總蛋白的19.5%~23.1%(Mujoo等,2003)和總球蛋白的40.0%(李德發,2003)。Glycinin是相對分子量為320~360 kDa的六聚體,其單聚體亞基的結構形式為A-S-S-B。其中A為酸性多肽,B為堿性多肽,A和B的分子量分別為34~44 kDa和20 kDa。S-S是一個二硫鍵,它將A和B連接起來,分別標示為A1aB2、A1bB1b、A2B1a、A3B4和A5B3等(Maruyama等,1998)。Glycinin在構型上為兩個環狀六角形結構,每個環上含6個亞基,分別以酸性和堿性亞基形式交互形成穩定結構,12個亞基組成了兩個相同的六角形結構,形成中空的扁圓柱。兩個六角形間的結合由靜電或氫鍵作用維系。六角環內是亞基之間的相互作用,酸性亞基和堿性亞基交互排列,各酸性亞基之間和堿性亞基之間均具有很高的同源性(Staswick 等,1981)。 

Glycinin酸性亞基和堿性亞基的等電點分別為4.80~5.50和6.50~8.50。Glycinin含有較多的含硫氨基酸,一些化學試劑(如尿素、強酸、強堿、十二磺基硫酸鈉、巰基乙醇、硫化鈉和亞硒酸鈉等)可打斷其二硫鍵,從而改變glycinin的四級結構,并增加其溶解度(Awazuhara等,2002)。溫度對glycinin的結構和溶解性也有較大影響,冷凍干燥和低溫貯存將降低glycinin的溶解度,而加熱則增加其黏度,形成預凝膠,并在冷卻后形成凝膠。Glycinin溶液在低溫貯存時還會發生二硫鍵聚合現象,形成不溶的沉淀或大小不同(14~22S)的聚合體(周瑞寶和周兵,1998)。 

1.2 β-conglycinin 

β-conglycinin也是大豆中的一種主要貯藏蛋白,占大豆籽實總蛋白的10.0%~12.7%和總球蛋白的30.0%(Mujoo等,2003)。不過,β-conglycinin比glycinin含有更多的糖基(3.8%甘露糖和1.2%氨基葡萄糖)。因此,β-conglycinin是一類糖基化蛋白質(張雪梅和郭順堂,2003)。Catsimpoolas和Ekenstam(1969)用免疫電泳方法將conglycinin分為α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin,其中α-conglycinin是具有酶活性的2S蛋白質組分;β-conglycinin和γ-conglycinin則不具有酶的活性,在中性環境和離子強度為0.05~0.10的條件下,可將β-conglycinin和γ-conglycinin分開。β-conglycinin由α、α’和β三種亞基組成,三種亞基的分子量分別為58~77、58~83和42~53 kDa(Thanh和Shibasaki,1977;Maruyama等,2003;Mujoo等,2003)。α、α’和β亞基的等電點分別為4.90、5.18和5.66~6.00(Lei和Reeck,1987)。在β-conglycinin空間結構中,α-螺旋、β-折疊和不規則結構分別占5%、35%和60%。β-conglycinin的穩定性比glycinin差,其在離子強度變化時不穩定,常發生聚合或離析作用。在高離子強度下,β-conglycinin存在一個7S沉降系數;在低離子強度下,β-conglycinin可聚合成9~10S蛋白。鹽可促進β-conglycinin凝膠的形成。除Na2CO3外,所有的水合鹽均可增加β-conglycinin的熱穩定性。β-conglycinin的三個亞基都富含天冬氨酸/天門冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸,其中α和α’亞基的氨基酸組成非常相似,二者均含有少量的蛋氨酸但缺乏胱氨酸,而β亞基則不含蛋氨酸。三個亞基的熱穩定性順序為:β>α’>α(Maruyama等,2003)。 

作為大豆的主要球蛋白,glycinin和β-conglycinin提供了大豆食品和飼料中總蛋白65%~80%的蛋白質(Thanh等,1976;sission等,1982)。但是,glycinin、α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin都具有免疫原性,都能不同程度地導致仔豬的過敏反應,尤其以glycinin和β-conglycinin的免疫原性最強。不過,導致過敏反應的具有抗原活性的大豆glycinin和β-conglycinin只占其中很少一部分。大豆制品中究竟有多少glycinin和β-conglycinin具有抗原活性,實際上與其加工工藝密切相關。 

2 大豆抗原蛋白對仔豬的影響 

大量的研究發現,包括大豆蛋白在內的日糧抗原過敏反應是造成仔豬腸道功能變化的主要原因,且與腹瀉的發生有著密切的關系。Glycinin和β-conglycinin作為大豆中的兩種最重要的抗原蛋白,主要引起仔豬的過敏反應。當仔豬采食含大豆蛋白的日糧后,大部分Glycinin和β-conglycinin被降解為肽和氨基酸。由于仔豬腸道發育不成熟,少部分glycinin和β-conglycinin穿過小腸上皮細胞間或上皮細胞內的空隙完整地進入血液和淋巴,刺激腸道免疫組織,產生包括特異性抗原抗體反應和T淋巴細胞介導的遲發性過敏反應,前者刺激肥大細胞釋放組胺,引起上皮細胞通透性增加和黏膜水腫,后者主要引起腸道形態變化,并表現為:小腸絨毛萎縮、脫落,隱窩細胞增生(Li等,1990),血清中大豆抗原特異性抗體滴度升高(Li,1991),結果導致消化吸收障礙、生長受阻和過敏性腹瀉的發生。 

2.1 大豆抗原蛋白對仔豬免疫系統的影響 

仔豬采食日糧抗原后,大部分蛋白質和碳水化合物等大分子物質在消化酶的作用下被消化成沒有抗原性的小分子物質,但仍有一小部分以完整的大分子形式通過腸上皮細胞間的空隙進入血液和淋巴,這些具有抗原活性的大分子物質刺激機體產生分泌型IgA (Swarbrick,1979)、血清IgA(Kilshaw和Sissons,1979)及血清IgE(Barratt等,1978)。分泌型IgA在機體對日糧抗原的免疫耐受性和免疫排斥中起主要作用。血清IgA能和吸收的抗原特異性結合形成IgA-抗原復合物,這種復合物很快被肝膽系統清除(Russel等,1982)。血清IgE和IgM能中和被吸收進血液中的抗原,中和后形成的抗原抗體復合物,引起機體免疫損傷,其中IgE是日糧抗原引起免疫損傷的主要抗體。IgE具有親細胞性,其Fc片段與組織中肥大細胞上的Fc受體結合,從而使機體處于致敏狀態。當日糧抗原再次進入機體后,抗原與結合在肥大細胞上的IgE結合,使肥大細胞釋放組胺等細胞介質,釋放的速度在結合后的15 min達到高峰,釋放的時間可持續1 h(Stokes等,1986)。從而引起血漿蛋白質漏入腸腔、腸黏膜水腫、杯狀細胞黏液滲出及腸道對水和電解質吸收不良。 

2.2 大豆抗原蛋白對仔豬腸道形態的影響 
斷奶仔豬對大豆抗原蛋白的過敏反應包括特異性抗原抗體反應和T淋巴細胞介導的遲發型過敏反應兩個方面,它們在腸道功能異常中所起的作用是不一樣的,前者刺激肥大細胞釋放組胺,引起上皮細胞通透性增加和黏膜水腫,而后者主要引起腸道形態的變化。已有的研究結果表明,在glycinin和β-conglycinin引起的斷奶仔豬的過敏反應中,T淋巴細胞介導的遲發型過敏反應引起的腸道形態變化是主要方面。Li等(1990)報道,給7日齡的仔豬灌服大豆蛋白提取液,每天6 g,連續5 d,21日齡斷奶后喂以含有相應大豆蛋白的斷奶日糧,在血清中測出了較高效價的抗glycinin和β-conglycinin的抗體;斷奶后第7 d測得的絨毛高度顯著低于飼喂牛乳的對照組,隱窩深度和絨毛寬度顯著低于對照組;用電鏡對絨毛發育的觀察表明,與飼喂牛乳的對照組仔豬相比,飼喂大豆蛋白的仔豬刷狀緣上皮細胞不完整,且有細胞融合的現象。連續飼喂6 d后,皮下注射1:1的glycinin和β-conglycinin均勻混合物,皮褶厚度顯著增加,這些變化與絨毛結構的變化一致,并與生產性能有較大的相關性。 

2.3 大豆抗原蛋白對仔豬生產性能的影響 

Dréau等(1993)給21日齡斷奶仔豬飼喂大豆抗原后發現,與對照組相比,飼喂大豆抗原的仔豬體重降低了10.0%(P<0.01),絨毛面積減少了37.0%(P< 0.01),但隱窩深度無明顯變化;與形態學變化相一致,黏膜上皮總淋巴細胞密度增加了31.6%(P<0.001);小腸發生炎性反應,黏膜上皮噬酸性細胞密度增加了10倍(P<0.001)。Li等(1991)通過組織學檢查、木糖吸收試驗和生產性能分析,研究了斷奶仔豬腸道損傷和吸收受阻與生產性能下降的關系。結果表明,大豆抗原引起的腸道損傷導致了腸道吸收功能的障礙,使仔豬對營養物質的消化吸收率降低,進而導致生產性能下降。 

2.4 大豆抗原蛋白與仔豬斷奶后腹瀉 

在早期的研究中,人們認為斷奶仔豬腹瀉是由于大腸桿菌性腸炎引起的,但后來的研究發現,仔豬斷奶后出現腹瀉雖然與大腸桿菌有著密切關系,但大腸桿菌本身并不能單獨引起這種疾?。∕iller等,1984),且健康仔豬的胃腸道中存在著大量的病原性大腸桿菌。仔豬對斷奶日糧中包括glycinin和β-conglycinin在內的抗原蛋白的短暫過敏反應引起的腸道損傷是斷奶后腹瀉的原發性原因,大腸桿菌在腸道的附著和增殖只不過是繼發性原因(Miller等,1984;Li 等,1990)。 
仔豬斷奶后腹瀉的直接原因是養分消化率的下降,而根本原因是機體對日糧抗原發生的過敏反應,這一理論已被許多試驗所證實。Kenworthy等(1976)報道,仔豬斷奶后前幾天發生的腹瀉,典型的損傷是腸絨毛嚴重萎縮,酶水平下降,養分吸收率下降,但微生物檢查并未發現大腸桿菌的增殖。Stokes(1986)對未斷奶仔豬用卵清白蛋白誘發免疫反應時,仔豬腸道產生類似的損傷性變化。仔豬斷奶前適當地補飼少量抗原可以刺激機體發生免疫反應,但再次接觸該抗原時仔豬會經歷二次免疫,導致更加嚴重的腹瀉和吸收障礙。據此,他們提出日糧抗原的過敏原性是斷奶后腹瀉發生的關鍵。譙仕彥和李德發(1996)的研究表明,仔豬斷奶后第8 d腸道中致病性大腸桿菌與血清抗大豆glycinin和β-conglycinin抗體效價成正比。不過,也有試驗研究表明,動物在斷奶前食入一定量的斷奶日糧,斷奶后并沒有腹瀉發生(Newby,1979),其原因可能是仔豬對日糧抗原產生了免疫耐受。  

3 大豆抗原蛋白的致過敏作用機理 

自Duke等(1934)首次注意到大豆抗原蛋白對嬰兒的反應原性后,人們對這種過敏反應現象和可能的作用機理進行了長期的探索。日糧抗原導致的過敏反應既有特異性抗原抗體間的Ⅰ型過敏反應,又有由特異性T淋巴細胞介導的Ⅳ型過敏反應。在不同的日糧抗原所引起的過敏反應中,這兩種反應的程度不同。常規處理下,大豆中的主要抗營養因子可被降低至無害水平,但大豆中的致敏因子的活性卻基本不受影響。 
動物因其種類、品種及所處的環境不同,對大豆抗原蛋白過敏的反應也不同,但其機制基本相似。腸道對抗原蛋白吸收增加是引起過敏反應的決定性因素(Walker-smith,1986),而特異性免疫力不足是抗原蛋白大量透過腸道進入血液循環的主要原因。動物飼喂一種新的日糧,將產生針對該日糧中抗原的相應抗體(譙仕彥和李德發,1995),如分泌型IgA,血清型IgA、IgE、IgM和IgG。從腸道吸收的抗原在血液中和相應的抗體結合形成抗原-抗體復合物。分泌型IgA在腸道內可直接中和日糧抗原,從而阻止抗原被小腸吸收。血清型IgA與循環中的日糧抗原形成的復合物相對缺乏免疫藥理作用(王彩虹等,1997),可很快被肝膽系統清除(王世若等,1996)。因此,IgA對阻止日糧抗原入侵以及對已入侵的抗原予以清除具有重要作用。其它幾種抗體與抗原形成的復合物則具有較強的藥理作用。IgM或IgG與抗原形成的復合物一旦穿過腸壁進入循環則可刺激全身的淋巴結并產生較多的IgM或IgG。循環中的IgM/IgG-抗原復合物可沉積在腸壁組織內,通過激活補體系統釋放出過敏毒素和血管通透性增強因子。同時,抗原-抗體復合物還可黏附于血小板上,促使活性胺的釋放,或引起嗜中性粒細胞對其吞食,由嗜中性粒細胞釋放出各種蛋白水解酶,引起組織損傷(即三型變態反應)。IgE的Fc片段可與組織中的肥大細胞上的Fc受體結合,使機體致敏。當日糧抗原再次進入機體后,抗原與結合在肥大細胞上的IgE結合而導致組胺快速釋放(Ⅰ型變態反應),結果毛細血管滲透性增加,血漿蛋白漏入腸腔,出現腸黏膜水腫等。 

大豆抗原蛋白引起過敏反應造成的免疫損傷主要發生在腸道,包括上皮淋巴細胞增加、隱窩細胞有絲分裂速度加快、血漿蛋白漏入腸腔、杯狀細胞黏液滲出以及腸絨毛結構變化。細胞免疫和體液免疫參加了這一過程,但絨毛結構的變化主要是由細胞免疫引起的,這種作用使小腸結構受損、食糜滯留時間縮短,營養物質轉運和吸收出現紊亂,最終導致消化不良和腹瀉(Lalles等,1993)。 

目前,由于受提純方法的限制,很難獲得大量、高純度的大豆抗原蛋白樣品,因此很少有試驗以純蛋白分子的glycinin或β-conglycinin為研究對象探討其對畜禽的致敏機理,而更多的是集中于整個大豆蛋白的共同作用。因此,獲得大量的純品抗原蛋白具有極其重要的意義。在Thanh和Shibasak(1976)方法的基礎上,游金明(2007)用免疫親和層析、郭鵬飛(2007)用基因表達的方法分別獲得了純度大于93%和99%的β-conglycinin及其α'亞基。Guo等(2007a)隨后以大鼠為實驗動物建立了過敏反應模型,將體內與體外試驗相結合,系統研究了β-conglycinin及其α'亞基對大鼠的致敏作用。結果發現,在灌服β-conglycinin及其α'亞基后,大鼠的IgE和IgG1抗體濃度顯著升高(P<0.05),腸道中肥大細胞數量增加,肥大細胞脫?,F象明顯;腸道組織中組胺的釋放率和釋放量增加;淋巴細胞過度增殖,CD4+顯著升高,血液和脾臟中的IL-2、IL-4和IL-5的分泌量增加。在后來的研究中,Guo等(2007b)進一步證實了大豆β-conglycinin對大鼠細胞免疫和體液免疫功能的影響。這些免疫反應最終引起小腸炎癥及上皮細胞變性壞死,造成免疫功能和組織器官的損傷及消化吸收不良。 

4 加工處理對大豆抗原蛋白免疫原性的影響 

大豆glycinin、β-conglycinin是熱穩定性的抗原蛋白,直接加熱并不能徹底破壞其抗原活性。經過加熱處理的大豆制品仍可引起斷奶仔豬和犢牛的消化異常和腸道黏膜的炎癥反應。與glycinin相比,β-conglycinin的熱穩定性相對較差,因此,破壞速度相對較快。生大豆(CP 36.5%)中β-conglycinin的含量約為155 mg/g,烘烤大豆中含量為52 mg/g(Murphy和Resurreccion,1984),而經過乙醇浸提獲得的大豆濃縮蛋白(Soy protein concentrate,SPC)中β-conglycinin的含量則降低至5 mg/g左右(Russett,1997)。另外,膨化大豆中雖然glycinin的含量仍然較高,但β-conglycinin的含量大為降低。經過適當加工處理后的大豆,雖然無法徹底破壞其抗原蛋白的活性,但可以在一定程度上減輕其對畜禽的致敏作用。Li等(1991)和譙仕彥等 (1995)對斷奶仔豬試驗的結果證實,經過膨化處理的豆粕能降低仔豬血清中抗glycinin、β-conglycinin抗體的滴度,并能降低glycinin、β-conglycinin引起的遲發型過敏反應程度。目前已證實,豆粕、膨化大豆、發酵豆粕、大豆濃縮蛋白和大豆分離蛋白等大豆制品的抗原活性低于生大豆。但是,在大豆加工參數和抗原蛋白活性的致敏臨界值方面還沒有一個統一的認識,其原因主要是抗原蛋白活性的定量檢測技術還很薄弱。已有的定量檢測方法主要以抗血清測定和高效液相色譜分析為主。這些方法從免疫學角度來看仍存在一定的缺陷,前者檢測的靈敏度較低,后者則無法體現免疫反應性,并且由于前處理過程繁瑣和需要昂貴的專門儀器而難以廣泛應用于大豆制品的現場檢測。You等(2007)以β-conglycinin分子上的一段抗原表位肽為半抗原,與載體蛋白OVA交聯后作為免疫原,成功制備了能夠識別α與α'亞基的抗β-conglycinin單克隆抗體。以該抗體為基礎建立的β-conglycinin定量ELISA方法應用于大豆制品的檢測,檢測限高達2.0 ng/ml。因此,抗β-conglycinin單克隆抗體的制備為β-conglycinin免疫原性的定量分析提供了一個有效工具,同時,為指導大豆的正確加工以減少或消除大豆抗原蛋白的免疫活性,提高大豆的利用效率奠定了基礎。

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